Introduktion:-

Laborationen går ut på att rena rekombinanta plasmider från E.coli bakterier och kontrollera om insertet i plasmiderna är gen LL37 som kodar för en antibakteriell peptid.

Laborationen pågår under fyra olika tillfällen, under fyra olika dagar.

Dag 1 :

Rening av rekombinant plasmid enligt Qiagen metoden.

Vi började laborationen med att rena de rekombinanta plasmiderna från E.coli, reningen består av tre steg.

Första steget : bakterierna separerades från näringslösningen som de har vuxit i genom centrifugering.

Andra steget : alkalisk denaturering togs celldebris,kromosomalt DNA ,proteiner och en del RNA bort.

Tredje steget: Silica kolunn.

Slut resultat: de  komponenter hamnade   i supernatanten, medan plasmid DNA kvar i röret.

Sen kontrollerade vi koncentrationen och renhet från protein hos plasmiderna m h a spektrofotometer.

Vid 260 nm fick vi Abs på 0,083, däremot vid 280 nm fick vi Abs 0,055.

För att veta om plasmid prepen är ren från protein tittar man på kvoten A260/A280. Är kvoten mellan 1,8 - 1,9 så är det rent från protein. Skulle kvoten vara lägre tyder det på att det fortfarande finns protein i palsmid prepen. Denna metod talar inte om det finns RNA kvar. För att ta reda på det använder man sig av gelelektrofores.

Vår kvot var 1,51, och koncentrationen var 0,415 µg / µL för den 100 ggr utspädda DNAt vilket betyder att vi hade föroreningar men det talar inte om det är protein eller inte. Så i nästa steg kommer vi att använda elektrofores för att kunna se mer detaljer om vår plasmider.