Dag 4

Under dag 3 utförde vi Southern blot, tillverkade prob ,prehybridisering och hybridisering. Och under dag 4 tvättade vi vårt membran och sedan detekterade vi vårt mål, dvs LL-37 gen som finns i plasmid DNA.
När vi utförde PCR och elektrofores under dag 2 var snabb och relativt enkel att utföra,men risken för carry-over kontamination och att optimera rekationen för att undvika ospecifika produkter.Men då fick vi inte vårt önskade resultat p g a bufferten med lågt pH-värde som ledde till att vi fick inga band.

Under dag 3 fortsatta vi vår laboration på att utföra Sorthern blot,som var enkel metod men tog lång tid.Då fick DNA-molekyler bundet till membranet och sedan tillsatte vi prober som vi tillverkade till membranet för att detektera LL 37-gen. Efter ca fem minuter började vi se vårt membran, då fick vi inte vårt resultat. Vi lämnade vårt membran i mörk ca 4 och fick det resultatet.

Anledningen till att vi inte fick vårt mål efter ca fem kan vara något fel i vår prober eller var fel på antikropparna, eller själva detektionen. Själv tror jag att det fel på tillverkning av prober. Tack och lov att vi fick LL 37 genen och vektor som syns tydligt.

Det är klart att vi gjorde misstag, men ändå har jag  fått träna på många praktiska moment t ex gelgjutning vilket är bra och jag önskar att vi kunde få mer tid till detta. Det är stor skillnad mellan att läsa om metoder och att praktiskt utföra dem.
Sen är det ju väldigt bra att få pröva på olika metoder så att man själv ge bilda sig en uppfattning om deras tillämpningar och begränsningar.
Det viktigast var nog ändå att få en övning i att planera och lägga upp sitt arbete lite mer självständigt än tidigare och att faktiskt få en förståelse för vad det är man gör och varför man gör det så att man kan förstå och tolka resultatet.

Dag 2

Dag 2
PCR-reaktion för kontroll av insert. Kontroll av plasmidpreparat och PCR-produkt med gelelektrofores och Klyvning av plasmid-DNA med EcoR1.

I dag 2 utförde vi PCR-reaktion för att få många kopior av DNA molekyl, och det gick helt perfekt.
Med hjälp av gelelektrofores skulle vi kunna veta om plasmid DNA har LL 37 gen eller inte, samt att kontrollera om vi inte har carry over kontamination. Men tyvärr vi kunde inte veta ingenting om vårt DNA !!!. Då använde vi TAE-buffert som hade pH vid 4 istället för 7 eller 8. Brunnarna som vi hade var blåa i början,men efter ca 30 min ändrades färgen och blev gul, det p g a den sur miljön och det leder till att bli för mycket positiva protoner som påverkar på DNA laddning. Vårt DNA blev positiv laddat och det gör att den blåa färgen inte binda.

Så vi kunde inte nå vårt syfte med denna laboration så vi ska köra gelelektrofores nästa vecka.

Introduktion:-

Laborationen går ut på att rena rekombinanta plasmider från E.coli bakterier och kontrollera om insertet i plasmiderna är gen LL37 som kodar för en antibakteriell peptid.

Laborationen pågår under fyra olika tillfällen, under fyra olika dagar.

Dag 1 :

Rening av rekombinant plasmid enligt Qiagen metoden.

Vi började laborationen med att rena de rekombinanta plasmiderna från E.coli, reningen består av tre steg.

Första steget : bakterierna separerades från näringslösningen som de har vuxit i genom centrifugering.

Andra steget : alkalisk denaturering togs celldebris,kromosomalt DNA ,proteiner och en del RNA bort.

Tredje steget: Silica kolunn.

Slut resultat: de  komponenter hamnade   i supernatanten, medan plasmid DNA kvar i röret.

Sen kontrollerade vi koncentrationen och renhet från protein hos plasmiderna m h a spektrofotometer.

Vid 260 nm fick vi Abs på 0,083, däremot vid 280 nm fick vi Abs 0,055.

För att veta om plasmid prepen är ren från protein tittar man på kvoten A260/A280. Är kvoten mellan 1,8 - 1,9 så är det rent från protein. Skulle kvoten vara lägre tyder det på att det fortfarande finns protein i palsmid prepen. Denna metod talar inte om det finns RNA kvar. För att ta reda på det använder man sig av gelelektrofores.

Vår kvot var 1,51, och koncentrationen var 0,415 µg / µL för den 100 ggr utspädda DNAt vilket betyder att vi hade föroreningar men det talar inte om det är protein eller inte. Så i nästa steg kommer vi att använda elektrofores för att kunna se mer detaljer om vår plasmider.